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人白介素1试剂盒IL-1α ELISA kit
更新时间：2013-06-19
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IL-1a ELISA 试剂盒
用途：
人IL-1a ELISA 试剂盒用于体外定量检测人血清、血浆、缓冲液或细胞培养液中的IL-1a。
本实验可以检测天然的和重组的IL-1a。本试剂盒于研究，而非用于诊断。
试验原理：
IL-1a 试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。抗IL-1a 特异多克隆抗体包被微孔
板，已知IL-1a 浓度的标准样本、对照样本和未知样本加入微孔内进行检测。
先将IL-1a 抗原和生物素标记的抗IL-1a 特异单克隆抗体同时孵育。洗涤后，加入亲和素过
氧化物酶。再经过孵育和洗涤，去除未结合的酶，然后加入酶复合物的作用底物，产生颜色
反应。颜色的深浅和样本中IL-1a 的浓度呈比例关系。
提供的试剂和配制方法：
究，而非用于诊断。
| 试剂（2~8℃保存） | 数量 | 色标 | 配制 |
| 96 微孔板 | 1 | | 即用型 |
| 塑料盖板 | 2 | | |
| 标准品：1000pg/ml | 2 支冻干粉 | 黄色 | 按标签要求以标准稀释液稀释 |
| 质控 | 2 支冻干粉 | 银色 | 按标签要求以标准稀释液稀释 |
| 标准稀释缓冲液 | 1 支（25ml） | 黑色 | 10 倍浓缩液，用蒸馏水稀释 |
| 人血清标准稀释液 | 1 支（7ml） | 黑色 | 即用型 |
| 生物素标记的抗IL-1a | 1 支（0.4ml） | 红色 | 用生物素标记抗体稀释液稀释 |
| 生物素标记抗体稀释液 | 1 支（13ml） | 红色 | 即用型 |
| 亲和素HRP | 2 支（5ul） | | 0.5mlHRP 稀释液预稀释 |
| HRP 稀释液 | 1 支（23ml） | 红色 | 即用型 |
| 洗涤液 | 1 支（10ml） | 白色 | 200X， 用蒸馏水稀释 |
| TMB | 1 支（11ml） | | 即用型 |
| 硫酸终止液 | 1 支（11ml） | 黑色 | 即用型 |
试验需要但未提供的用品：
蒸馏水
微量加样器：10ul,50ul,100ul,200ul,1000ul
旋涡振荡器和磁力搅拌器
安全性：
仅用于科研
本试验所用的人血成分均经检测，不含有HbsAg 和抗HIV 阳性物质。尽管如此，无法
确保没有传播肝炎或艾滋病等的可能。因此处理这些血清、血浆样本时，应该遵守
有关的安全操作规程，例如CDC/NIH 健康手册：“微生物学和生物医学试验中的安全”
/1984。
→ 避免硫酸和TMB 与皮肤接触。如有接触，可用水*冲洗。
→ 不可在使用试剂盒的地方吃饭、饮水、吸烟或化妆。
→ 不可用口吸取样本。
操作要点/试验室质量控制：
1、 使用前应根据标签上指示冷藏。使用时所有试剂应平衡至室温。冻干标准品使用后
应丢弃。
2、 取出所需的孔条后，立即密封包装，以防变质。
3、 不用时所有试剂要加盖封好。
4、 不同批号的试剂不可混用。
5、 过期的试剂不可再用。
6、 使用干净的吸头来吸取各种试剂、标准品、对照或样本，以防交叉污染。吸取硫酸
或底物溶液时，避免使用带金属部分的加样器。
7、 用干净的塑料容器配备洗涤液。
8、 使用前用振荡器*混匀各种试剂。
9、 微孔内残留液须充分吸干或在吸水纸上拍干，吸水纸不可插入孔内吸水。
10、 TMB溶液是光敏的，避免长时光照。避免与金属接触产生颜色反应。
警告：TMB 有毒，避免手直接接触，并妥当处理。
11、 如配制后几分钟产生深兰色，表明TMB 溶液被污染，必须弃去。在检测完成
后一小时内必须读结果。
12、 吸取样本时，按顺序逐孔加样，以确保孵育时间相同。
13、 孵育时间见操作规程。
14、 在洗涤微孔板之后15 分钟内加入TMB 溶液。
样品收集，处理和保存
1、 细胞培养上清液——1000xg 离心10 分钟去除颗粒和聚合物。
2、 血清——操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液
后，1000xg 离心10 分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
3、 血浆——EDTA，柠檬酸盐和肝素血浆可用于检测。1000Xg 离心30 分钟去除颗粒。
4、 保存——如果样品不直接使用，将其分为小部分（250-500ul）-70℃下保存，避免
反复冷冻。如果可能，不要使用溶血和高脂血。如果血清中有大量的颗粒，检测前
先离心或过滤。
注意：不要在37℃或56℃加热解冻。在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
试剂准备：
1、标准稀释缓冲液
蒸馏水10 倍稀释。
2、标准品
对不同的待测样品，此试剂盒提供两种标准稀释液。因为生物液体可能含蛋白酶或
细胞因子结合蛋白，从而影响对待测细胞因子的识别。应使用相应的标准稀释液稀
释标准品。
血清和血浆样品使用人血清标准稀释液稀释；细胞培养上清液用标准稀释缓冲液稀
释。按标签说明进行稀释，稀释后浓度为1000pg/ml IL-1a，可储存。系列稀释须在
每次检测前准备，稀释前将标准品轻轻振荡5 分钟。
3、对照
对照也应按样品种类选择相应的标准稀释液。按标签要求以标准稀释液配制。加样
前轻轻振荡对照5 分钟。稀释后不能储存。
4、 生物素标记的抗IL-1a 的稀释
生物素标记的抗IL-1a 用生物素标记抗体稀释液根据使用微孔数在干净玻璃管中稀
释。实验时准备。参见下表：
| 使用微孔数 | 生物素标记的抗体（ul） | 生物素标记抗体稀释液（ul） |
| 16 | 40 | 1060 |
| 24 | 60 | 1590 |
| 32 | 80 | 2120 |
| 48 | 120 | 3180 |
| 96 | 240 | 6360 |
5、 亲和素HRP 的稀释
在含5ul 亲和素HRP 的瓶内加入0.5ml HRP 稀释液。本液为一次性使用。
根据使用微孔数在干净玻璃管中进一步稀释。参见下表：
| 使用微孔数 | 亲和素HRP（ul） | HRP 稀释液（ml） |
| 16 | 30 | 2 |
| 24 | 45 | 3 |
| 32 | 60 | 4 |
| 48 | 75 | 5 |
| 96 | 150 | 10 |
6、 洗涤缓冲液的稀释
蒸馏水200 倍稀释。
检测方法：
1、 试剂用前充分混匀，避免产生泡沫。
2、 确定需要的微孔数，所有样本、标准品、空白和对照样本均要做双份。
3、 吸取200ul 标准品（见试剂的准备）到A1, A2 孔，100ul 标准稀释液到B1, B2, C1, C2,
D1,D2, E1,E2, F1, F2 孔（见下表）。从A1, A2 孔吸取100ul 到B1, B2 孔，用加样器反
复吸排使其混合。小心不要擦到孔的内表面。同样从B1, B2 孔吸取100ul 到C1,C2；再
从C1,C2 到D1,D2 等，从zui后的两个孔（F1, F2）中吸去100ul 不要。这样从A1,A2
到F1,F2，IL-1a 标准品稀释液的浓度为1000pg/ml 到31.25pg/ml。也可在试管中进行
此稀释，将稀释后的标准品直接加入反应孔中。
4、 加100ul 配好的标准稀释液至空白孔G1,G2。
5、 加100ul 样本至样本孔和100ul 对照至对照孔H1,H2。
6、 盖上微孔板，室温下（18 至25℃）孵育2 小时。
7、 洗涤微孔板：① 吸去孔内液
② 加0.3ml 洗涤液于各孔
③ 再吸去各孔内液
④ 重复②和③二次
8、 配制生物素标记的抗IL-1a。（配制见前述）
9、 加50ul 生物素标记的抗IL-1a 稀释液于所有孔内。
10、 盖上微孔板，室温下（18 至25℃）孵育1 小时。
11、 洗涤微孔板。（见步骤7）
12、 仅在用前配制亲和素HRP 液。（配制见前述）
13、 加100ul 亲和素HRP 液于各孔，含空白孔。加盖。
14、 室温下孵育半小时。
15、 洗涤微孔板。（见步骤7）
16、 加100ulTMB 底物液至各孔。室温下避光孵育15 至20 分钟。
17、 通常根据ELISA 阅读器确定孵育时间：许多ELISA 阅读器仅读数至2.0 O.D 值。
监察O.D 值，应在阳性结果衰褪前终止反应。（不超过20 分钟）
18、 用100ul 硫酸加入各孔终止酶底物反应。终止反应后1 小时内（这段时间在2 至
8℃避光保存）或加入硫酸后立即读取结果。
19、 用分光光度仪读数，450nm 作为初始波长，620nm（可以用610 至650nm）作为
参考波长。
建议微孔板编码：
| | 标准浓度（pg/ml） | 样本孔 | ||||||||||
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| A | 1000 | 1000 | | | | | | | | | | |
| B | 500 | 500 | | | | | | | | | | |
| C | 250 | 250 | | | | | | | | | | |
| D | 125 | 125 | | | | | | | | | | |
| E | 62.5 | 62.5 | | | | | | | | | | |
| F | 31.25 | 31.25 | | | | | | | | | | |
| G | 空白 | 空白 | | | | | | | | | | |
| H | 对照 | 对照 | | | | | | | | | | |
结果分析：
制作一条标准曲线，平均光吸收值作Y 轴，对应的IL-1a 浓度作X 轴。各样本中的IL-1a 含
量根据样本O.D 值通过标准曲线来确定。
典型的mIL-1a 标准曲线（31.25-1000pg/ml）
本试验的局限性：
超过标准曲线范围（1000pg/ml）时，不可推测结果；样本必须稀释后再检测。
本试验的检测特性：
1、 敏感性：zui小检测浓度低于10 pg/ml。
2、 准确性：
| 批内 | 批间 | ||||||||
| 样本 | N | 均值（pg/ml） | SD | CV% | 样本 | N | 均值（pg/ml） | SD | CV % |
| A | 22 | 459.8 | 13.0 | 2.8 | A | 8 | 259.9 | 15.0 | 5.8 |
| B | 21 | 72.6 | 3.9 | 4.3 | B | 8 | 58.6 | 4.3 | 7.3 |
3、 稀释度的线性：将含有1000pg/mL IL-1a 的人血清用标准稀释缓冲液系列稀释。样本线
性回归与预期浓度相关系数为0.99。
4、 还原：人血清内IL-1a 浓度（1000 至31.25pg/ml）的还原值为95.3%（91%至100%）。
检测程序小结： 总时间 = 3 小时45 分钟
加100ul 样本或配好的标准品或对照
室温孵育2 小时
洗3 次
加50ul 配好的生物素标记的抗体于各孔内
室温孵育1 小时
洗3 次
加100ul 亲和素-HRP 标记物
室温孵育半小时
洗3 次
加100ul TMB，避光，显色12 至15 分钟
加100ul 硫酸，终止反应
在450nm 处读取吸光度
此说明书由北京博蕾德生物科技有限公司提供
注意：请以原文说明书为准
