HMGB(高迁移率族蛋白B1) zui近被认为是内毒素的晚期致命因子介质，并被普遍认为是一种炎症介质，在急性的临床炎症疾病中起到至关重要的作用。 HMGB1 蛋白由216个氨基酸组成， 小鼠、大鼠、牛、及人99% 的HMGB1氨基酸序列是相同的。HMGB1蛋白由三个结构域组成。分别为“A Box (氨基酸序列：9-85)”、B box(氨基酸序列：88-162)和一个带负电荷的羧基端（氨基酸序列：186-216）。此外，B-box 参与炎症反应活性而A Box 则被认为是作为一个拮抗剂的功能。 许多证据表明HMGB在炎症反应免疫应答中发挥的重要性。例如，已有研究表明，HMGB可以有许多细胞主动分泌，例如：巨噬细胞被LPS ,TNF 和IL-1 刺激后，主动分泌HMGB1蛋白，也可由坏死细胞被动释放。事实上，感染性休克死亡的病人血清中的HMGB1蛋白水平高于败血症病人。同样，在败血症动物模型及胶原诱导的关节炎模型血清中，也可检测到高水平的HMGB蛋白。关于这个蛋白的功能，HMGB1蛋白被认为起到促进细胞释放TNF和IL-1 细胞因子的功能及与LPS结合协同增加外周血单核细胞产生IL-6。总之，这些现象表明，HMGB1在炎症反应中起到重要作用。 Chondrex 公司提供捕获ELISA kit,用于检测细胞培养上清及小鼠血清中的HMGB1水平。试剂盒包含标准品及足够的试剂用于检测40个样品（复孔） 试剂盒组成 组成 | 数量 | 规格 | 保存温度 | HMGB1 标准品 | 2瓶 | 50ul/瓶 | -20°C | 捕获抗体（抗-HMGB1 单抗） | 1瓶 | 100ul/瓶 | -20°C | 检测抗体（抗-HMGB1 单抗） | 1瓶 | 冻干粉 | -20°C | 溶液A-捕获抗体稀释缓冲液 | 1瓶 | 10ml | -20°C | 溶液B-样品/标准品稀释缓冲液 | 1瓶 | 20ml | -20°C | 溶液C-检测抗体稀释缓冲液 | 1瓶 | 10ml | -20°C | 溶液D-链亲和素稀释缓冲液 | 1瓶 | 20ml | -20°C | 链亲和素 | 2瓶 | 50ul | -20°C | TMB 溶液 | 1瓶 | 12 ml | 4°C | 终止液 | 1瓶 | 12 ml | -20°C | 洗液，20X | 1瓶 | 10ml | -20°C | ELISA 板 | 1个 | 96孔板 （8x12 ） | -20°C |
注： - 推荐样品和标准品都进行复孔检测。
- 剩于的捕获抗体、检测抗体、链亲和素需储存于-20°C。
- 20X的洗液（Wash buffer）低温储存会结晶。如果有结晶，将Wash buffe 置于水浴中温育，直至晶体全部溶解。
- 缓冲液稀释前用移液器测量的准确体积。（提供足够的缓冲液）。
- 该试剂盒可用于检测 小鼠血清和细胞培养上清中HMGB1蛋白水平。用于分析人的血清HMGB1水平时，应特别注意。因为已有研究报道，有自身免疫疾病的病人产生的针对HMGB1的抗体在血清中占9-89%。这些血清中的多抗的存在，封闭了HMGB1抗原表位，从而影响试剂盒中捕获抗体和检测抗体对HMGB的结合。因此，在使用试剂盒之前对病人的疾病背景了解，至关重要。
操作程序： 1 加入捕获抗体：将捕获抗体（100ul）用10ml 溶液A 稀释后，每孔加入100ul稀释液， 4℃ 孵育overnight。 2 标准品稀释液的准备：推荐的标准品浓度梯度为：1.6-100ng/ml。在标准品（1瓶）中加入950ul稀释液溶液B，则终浓度为100ng/ml。取250ul 100ng/ml稀释液加入250ul溶液 B,则终浓度为50ng/ml。依次类推，重复5次，依次分别配成25 ng/ml，12.5ng/ul,6.25 ng/ml, 3.1 ng/ml,1.6ng/ml的稀释液。100ng/ml 的储存液不能够在后续试验中应用。倒掉多余的剩余标准品稀释液。推荐在每次试验时用新鲜的标准品稀释液。 3 样品稀释液的准备：4℃1000 rpm离心3min 去除一些不溶物和脂类物质，取上清作为试验样品。如果HMGB1蛋白水平超过100ng/ml，请配置更高的稀释度的样品稀释液。 4 检测抗体的准备：用5ml溶液C稀释检测抗体（1瓶） 5 洗脱缓冲液的稀释：用950ml 蒸馏水稀释50ml 20x洗脱储存液，配成1x 洗脱液。用1x 洗脱液至少洗版3次（或用自动洗版机）。甩去液体，倒扣板，置干净的吸水纸上，去除多余的液体。不要让板子*变干。 6 加入标准品，样品和检测抗体：混匀标准品，检测样本和检测抗体。按图1，空白孔加入50ul 溶液B，标准品和样品加到对应的孔中。加入50ul 稀释的检测抗体到各孔，用移液器（或振荡仪）上混匀检测抗体稀释液和标准品/样品稀释液。用封板膜封板，37 ℃孵育1小时，此后4 ℃ overnight。 
7 链亲和素的稀释：用10ml溶液D稀释链亲和素（1瓶） 8 洗涤：用1X 洗涤缓冲液洗板3次（至少）。甩去液体，倒扣板，置干净的吸水纸上，去除多余的液体。不要让板子*变干。 9 加入链酶亲和素：每孔加入100ul 链酶亲和素稀释液，室温孵育30min。孵育时间不要超过1小时。 10 洗涤：用1X 洗涤缓冲液洗板3次（至少）。甩去液体，倒扣板，置干净的吸水纸上，去除多余的液体。不要让板子*变干 11 TMB：洗涤后，立即每孔加入100 ul TMB。室温孵育30min。 12 终止：每孔加入50ul 终止液。 13 读数：30分钟内读取450nm 和 630nm 双波长OD值。 计算样品中HMGB1浓度 1 计算空白孔、标准品和样品的OD平均值。 2 计算标准品和样品的OD平均值减去空白孔的平均OD值。 3 HMGB1的浓度作为横坐标，OD的lg值作为纵坐标，做曲线。图2,示典型的HMGB1浓度从1.6ng/ml 到100ng/ml 标准曲线。 |
