天狼猩红总胶原检测试剂盒 Sirius Red Total Collagen Detection Assay Kit(Catalog # 9062) 仅用于科研,不可用于诊断 背景简介: 天狼星红是一种*的染料,它与纤维性胶原(I型至V型)上的[Gly-X-Y]n螺旋结构特异性结合,不区分胶原蛋白种类和胶原类型,因此用于总胶原的检测。Chondrex提供天狼星红总胶原蛋白检测试剂盒,用于检测样本,包括:组织、细胞培养液和细胞中的总胶原蛋白。该试剂盒可检测40例样本(复孔),实验时间少于30min。由于细胞培养液总的胶原含量较低,可能需要对样本做浓缩处理。 产品说明: 产品描述:用于检测样本中的总胶原 形式:96孔可拆版 检测方法:比色法 实验时间:30min 检测范围:500 µg/ml to 8 µg/m 检测数量:40(复孔)样本/板 样本类型:组织匀浆、细胞培养液、细胞 样本稀释比:根据样本类型而定 发色团:N/A(510-550nm读取) 保存:-20℃ 保存12个月 试剂盒组成: 组分 | 数量 | 规格 | 保存温度 | 标准品-牛II型胶原(90621) | 1 | 0.5 mg/ml, 1 ml | -20°C | 天狼猩红溶液(90622) | 1 | 50 ml | -20°C | 洗液(90623) | 1 | 50 ml | -20°C | 提取液(90624) | 1 | 30 ml | -20°C | 0.5M醋酸(10X醋酸)(90625) | 1 | 20ml | -20°C | 96孔板(9026) | 1 | 8-well strips x 12 | -20°C |
注:1)洗液,提取液,0.5M的醋酸和96孔板也可以室温保存 2)用于细胞培养液样本的的浓缩液(50 ml, Catalog # 90626))不包括在盒子内,需要单独订购。
样本制备: 可用于检测组织匀浆样本和细胞。固体样本需要溶解后检测。此外,细胞培养液需要做浓缩处理(请参照第三页实验步骤)。另外,热变性的胶原对天狼猩红的结合性差,会导致结果值偏低。 依据溶解缓冲液的不同,以下胶原样本可用于检测: 中性缓冲液溶解的胶原溶液(0.15mol/L NaCl in 0.1M Tris-HCl, pH 7.4) 醋酸溶解的胶原溶液(0.05mol/L的醋酸) 含胃蛋白酶的胶原溶液(0.05mol/L的醋酸,含胃蛋白酶)
Chondrex 推荐“制备含胃蛋白酶的可溶液胶原溶液"制备方案 细胞培养液样本制备: 含高浓度血清的细胞培养物会导致高背景值。因此,我们推荐用PBS降低细胞培养物中的血清浓度到5%。 样本浓缩: 细胞培养物中的血清浓度一般来说很低,因此用试剂盒直接检测细胞培养物中的胶原很难检测得到。Chondrex公司通过浓缩液(Cat # 90626)参照样本浓缩流程对样本进行浓缩。如果检测细胞培养物,请设置阴性对照,用浓缩液的话可能会导致背景升高。 加入1ml细胞培养液 加入250ul浓缩缓冲液 涡旋混匀后,4℃孵育16-24小时 10000rpm离心3min 弃上清液 加入100ul 0.05mol/L的醋酸溶解沉淀物。用溶解后的样本,作为检测样本。 样本中胶原浓度为测定值x0.1。
操作流程: 加入100ul稀释后的标准品和样本到管内。 加入500ul天狼猩红溶液到管内 混匀后,室温孵育20min,10000rmp离心3min,小心吸取上清,并弃上清。 加入250ul提取液到各管内。 涡旋混匀使沉淀物*溶解。 从各管内取200ul到检测板 读取530nm(510-550nm)吸光度
注意: 推荐标准品和样本均做复孔检测 所有的缓冲液在用前置于室温平衡。 用移液管准确定量缓冲液体积,提供的缓冲液都是足量的。 如果一次用不完的原液试剂,请还在原瓶内-20℃保存,用于后续实验。 试剂盒含有未感染的动物的动物组分,丢弃请做生物安全处理。
实验流程: 1X醋酸溶液制备:用双蒸水,制备足够的1X醋酸溶液(0.05M)。 标准品制备:用1.5ml离心管或者细胞培养管制备标准品溶液,加入250ul 0.05mol/L的醋酸(空白)到7管内。加入250ul标准品(500ug/ml)和等体积的0.05mol/L的醋酸混合(250ug/ml)。一次重复此步骤,制备:125,63,31.5,16,和8ug/ml标准品溶液
样本制备:用1.5ml离心管或者细胞培养管制备样本溶液。如果样本中的胶原浓度范围不确定,需要用0.05mol/L的醋酸溶液做系列稀释后,确定样本大概范围后再检测。 加入样本和标准品:加入100ul ,空白,稀释后的标准品和样本到离心管内,做复管。 加入天狼猩红溶液:加入500ul天狼猩红溶液到各管。涡旋混匀,室温孵育20min。 离心:10000rpm离心3min。去除上清,不要接触底部的沉淀物。如果不小心接触到,重新离心,小心去除上清。 加入洗液:加入500ul洗液到各管。涡旋混匀后,重悬沉淀物。 离心:10000rpm离心3min。去除上清,不要接触底部的沉淀物。如果不小心接触到,重新离心,小心去除上清。 加入提取液:加入250ul提取液到各管。涡旋混匀后,充分溶解。 读数:从各管取200ul到96孔板。读取510-550nm的吸光度值。
结果计算: 计算标准品,空白和检测样本的OD平均值。 用标准品和样本OD平均值减去空白OD均值。 Y轴做OD值,X轴做标准品浓度,制作标准曲线。 通过回归曲线计算样本浓度。样本实际浓度应在测值的基础上乘以相应的稀释倍数。 如果OD值超出标准品检测范围,请对样本做稀释后,再检测。
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