Hypoxyprobe™-1 Plus Kit 缺氧探针试剂盒

※缺氧探针试剂盒的如何选择？
Hypoxyprobe公司缺氧探针试剂盒核心组分为：缺氧探针（Pimonidazole 或CCI-103F）和缺氧探针的抗体。不同试剂盒中的探针和抗体标记不同。北京博蕾德生物是Hypoxyprobe公司总代理。现货常备以下几款缺氧探针试剂盒。
1) Hypoxyprobe™-1 Kit  此试剂盒适合于免疫荧光和免疫组化和流式检测，探针抗体不带标记，需要客户自己搭配相应的二抗，比如：免疫组化，需要搭配抗小鼠IgG-HRP 二抗，免疫荧光或流式可搭配FITC-抗小鼠IgG-HRP（或者相应的其他标记二抗）。此试剂盒应用灵活方便，适合同时对组化和荧光检测有需求的客户，也方便客户搭配不同的抗体标记，满足不同的实验需求。
2）Hypoxyprobe™-1 Plus Kit 此试剂盒适用于免疫荧光和免疫组化和流式检测。不需要搭配二抗。如果做免疫荧光，只需要用到探针和FITC标记的探针抗体，这2个组分。如果做免疫组化，需要用到第3个组分：兔抗FITC-HRP标记的抗体。该试剂盒的优点是，同时满足客户做免疫荧光和免疫组化要求，不需要客户自己搭配二抗。
3）Hypoxyprobe™-1 Omni Kit 此试剂盒与Hypoxyprobe™-1 Kit 不同的是探针的抗体来源不同，此试剂盒中的抗体为兔来源，探针抗体不带标记，需要客户自己搭配相应的二抗。比如：免疫组化，需要搭配抗兔IgG-HRP 二抗，免疫荧光或流式可搭配FITC-抗兔IgG-HRP（或者相应的其他标记二抗）。
4）Hypoxyprobe™ Green Kit 此试剂盒适合于免疫荧光和流式检测。探针抗体为FITC直接标记，可直接用于免疫荧光检测（直接免疫荧光）或流式检测，不需要搭配二抗。需要注意研究的组织如有自发荧光（绿光），比如GFP(一些转基因研究的客户)，不适合这款试剂盒。可以选择其他荧光标记的试剂盒，比如：Hypoxyprobe™ RedAPC（红光）。
5）Hypoxyprobe™ RedAPC此试剂盒适合于免疫荧光和流式检测。探针抗体为FITC直接标记，可直接用于免疫荧光检测（直接免疫荧光）或流式，操作简便，不需要搭配二抗。
※缺氧探针（派诺硝唑） 探针如何溶解？
派诺硝唑（Pimonidazole HCl）是弱碱性盐酸盐，水溶性非常好，建议溶解于中性缓冲液（生理盐水或蒸馏水都可以）。这种水溶性特征有利于在腹腔和静脉注射时，控制免疫剂量在0.1-0.5 mL之间。（派诺硝唑溶解度：116mg/ml）
※在缺氧标记时派诺硝唑（Pimonidazole HCl）免疫剂量是多少？
派诺硝唑与缺氧组织结合程度取决于硝基咪唑的还原率和组织相对派诺硝唑的结合率（结合率与派诺硝唑的浓度和作用时间成正比）。硝基咪唑的还原率很难预测，但是组织相对派诺硝唑的探针的结合率可以预测。以下是研究表明的给出的派诺硝唑的使用浓度：
1）在球状组织可以检测到强信号的缺氧标记染色，（ Exposure = 58mg/kg x 1 hour = 58mg/kg-hour.）
2）免疫剂量：0.5g/m2(14mg/kg)，在人肿瘤组织和正常细胞检测到强信号的缺氧标记染色。血浆中的派诺硝唑的半衰期是5小时。（Exposure = 14 mg/kg x 5 hours = 70 mg/kg-hour.）
3）在小鼠肿瘤组织检测到强信号的缺氧标记染色，免疫剂量：60mg/kg,血浆中Pimonidazole的半衰期是15min。（Exposure = 60mg/kg x 0.25 hours = 15 mg/kg - hour.）
总之，对于大小*的小动物，比如：实验室大鼠或小鼠，推荐的派诺硝唑的用量是：60mg/kg(kg:动物体重)，这个剂量是经济有效的剂量。
由于血流效应，没有毒性反应或没有氧浓度变化的的小鼠或大鼠，剂量控制在30 mg/kg to 400 mg/kg 。对于移植肿瘤（在小鼠后肢）派诺硝唑探针剂100mg/kg。
需要注意的是：大于100mg/kg的剂量仅用于移植肿瘤。
对于体重不*的大动物，具体用量取决于接触表面积。对于人的来说，推荐的用量是：0.5g/m2 ，而对于狗0.28g/m2。
※缺氧探针（Hypoxyprobe-1）是否能进入缺氧脑组织或肿瘤组织。
Hypoxyprobe-1 是水溶性的，其对应游离基醇/水系数8.5，因此缺氧探针能够自由进入脑组织以及脑肿瘤组织。
※派诺硝唑是否是体内检测缺氧的合适的标记物？
派诺硝唑被认为是缺氧检测的金标准标记物。其优点是：
1）水溶性好（116mg/ml 盐水），这样静脉或腹腔免疫动物时，可以把免疫量（体积）控制在较小体积。其他的标记物，例如： CCI-103F 探针水溶性为10mol 或者更低，这个探针常用于花生油，DMSO 配成乳剂用于腹腔注射，避免血液稀释。
2）稳定性好。固态探针4℃或常温性质非常稳定，可以保存数年。高浓度的探针水溶液，避光4℃保存可以保存数年。探针的抗体，可以再4℃保存1年以上。
3）非危险化学品。对于小鼠，派诺硝唑探针的半数致死量（LD50）是：728mg/kg，因此被认为是低毒性的非危险化学品。
4）适用于各种免疫检测。派诺硝唑探针检测可以用各种检测方法检测，例如：免疫荧光、免疫组化，ELISA ，流式等。
※派诺硝唑的探针抗体是否可以用于小鼠组织的检测？
是的。对于福尔马林固定的石蜡组织，我们推荐HRP 标记的F（ab）2二抗（例如：HRP - Goat F(ab')2 Anti-Mouse Ig）。这样会降低背景，可以用于不同种属的动物检测。
※探针激活和缺氧细胞结合原理是什么？
肿瘤乏氧细胞还原能力强，当具有电子亲合力的硝基咪唑主动扩散透过细胞脂膜，在细胞内硝基还原酶作用下，硝基被还原，还原产物与大分子物质不可逆结合，滞留在组织内。而正常含氧细胞亲电子硝基咪唑还原产物立即被氧化，从而用硝基咪唑类化合物在肿瘤内的代谢程度来反映肿瘤的乏氧。
※缺氧探针试剂盒中抗体（IgG1）浓度是多少？
Hp1-x盒子中抗体浓度：60ug/ml。Hp2-x, Hp6-x, Hp7-x,HP8-x,HP10-x中抗体浓度为500ug/ml，其它盒子中，兔来源的抗血清，没有纯化后的抗体IgG浓度确定确定。
※探针注射后，收货组织的时间是什么时候？
在收获组织过程中，组织会逐渐缺氧与探针结合，可能会出现一些假阳性。从时间上来讲，组织与探针结合时间要比收获组织时间长很多，因此在收货组织这个短时间内，信号会很弱，因此在此期间探针浓度是有限的，出现的假阳性是可以忽略的。
对于人组织的研究，活组织检查通常要在探针免疫后16-24小时后。探针在人血浆中的半衰期是5小时，因此16-24小时代表3-5个半衰期。也就是说在收货组织时：只有1/8 到1/32的初始探针浓度残留，组织固定后，较大程度的减少非特异性结合。
在其他的一些的人组织研究中，活组织检查通常要在探针免疫1-1.5小时，然后组织立即液氮固定。这种操作方法，背景也会很低。尽管这个时候收获组织：探针浓度在1.5-4小时内相对较高，组织固定时间相对探针和组织的作用时间太短，因此不会造成高背景。
对人组织的一些研究一些研究经验，对实验研究是很有指导意义的。探针免疫小鼠后，半衰期只有0.25小时。这种情况下，1-2小时收获组织后，低温快速冷冻固定，会终止非特异性结合。
※探针结合的氧分压临界值≤10mgHg是如何确定的？
A:在固体组织中很难确定硝基咪唑的氧化率。迄今为止，比较好的实验方法是来自于Gross et al.’s，比较氧电极测量氧分压和射线自显迹法测量放射物标记法。甲氧甲基硝基咪唑结合的颗粒密度10mmHg氧分压下，大量增加。其他的研究Chou et al. 也发现类似的结果。因此10 mm Hg是一个可信的探针与氧结合的临界值。

已知的关于缺氧探针在小鼠组织的半衰期？

※ 动物内体的氧氮反应是否影响派诺硝唑的标记效果？
派诺硝唑的Piperidine基团很容易氧化成N-氧化物代谢物。原则上，会影响派诺硝唑的对缺氧组织的标记效率。动物体内，缺氧探针的氧氮反应是通过含黄素单氧化酶（FMO）激活完成的。FMO在不同动物中的分布是不同的，因此在不同动物种属血浆中的氮氧化物水平是不同的。有趣的是，派诺硝唑的注射途径（静脉或口服）受血浆中氧氮物浓度影响很小。研究表明用：口服和静脉注射派诺硝唑探针给狗的肿瘤（用CCI-103F作为缺氧标记的对照探针）。强氧化剂例如：过氧酸是由于超氧化物阴离子与NO反应，也可以氧化派诺硝唑探针。尽管这样，NO的形成不会影响派诺硝唑的探针效果。
首先，通过还原血红素铁蛋白复合物 ，氧氮反应是可逆的以及通过组织还原酶，比如组织黄嘌呤脱氢酶以及还原细胞色素还原，派诺硝唑的氧化是有限的。
第二，通过其他探针的对照试验说明，对缺氧的标记程度不受血浆中氧氮化合物影响。
第三， 氧氮衍生物与派诺硝唑抗体没有交叉反应，因此对派诺硝唑的检测没有任何干扰。
※ 如果探针标记染色结果与组织缺氧结果不*怎么办？
迄今为止，通过派诺硝唑探针染色结果与组织缺氧检测结果一般是*的。
一般来讲，如果对派诺硝唑的标记结果有疑问。一种方法是，对注射派诺硝唑的动物吸氧10%，如果吸氧10%后的动物派诺硝唑探针结合程度显著提高，有可能缺氧有可能是由于派诺硝唑结合造成的。另一种方法是，用两种缺氧探针标记检测干预前后，组织氧压的变化。